Eletroforese em gel de agarose, como funciona e seus usos

Preencha o formulário abaixo e enviaremos por e-mail uma versão em PDF de "Eletroforese em gel de agarose, como funciona e seus usos"

Preencha o formulário abaixo para desbloquear o acesso a TODOS os artigos de áudio.

Leis simples da física determinam que quando a corrente é aplicada a um meio contendo espécies carregadas, essas espécies migrarão para a carga oposta. Dependendo do meio através do qual se movem, outras características – como o tamanho das espécies presentes – podem impactar o seu movimento, levando à separação. Esta é a base sobre a qual são construídas técnicas de eletroforese, como a eletroforese em gel de agarose – técnicas que são amplamente utilizadas nas ciências da vida.

Neste artigo, consideraremos como funciona a eletroforese em gel de agarose, como ela pode ser interpretada e algumas de suas finalidades.

A eletroforese é uma técnica que utiliza corrente elétrica para separar DNA, RNA ou proteínas com base em suas propriedades físicas, como tamanho e carga.

A eletroforese em gel de agarose é uma forma de eletroforese usada para a separação de fragmentos de ácido nucleico (DNA ou RNA) com base em seu tamanho. O DNA/RNA carregado negativamente migra através dos poros de um gel de agarose em direção à extremidade carregada positivamente do gel quando uma corrente elétrica é aplicada, com fragmentos menores migrando mais rapidamente. As bandas resultantes podem então ser visualizadas usando luz ultravioleta (UV).

No entanto, o ARN1 tende a formar estruturas secundárias – por vezes múltiplas espécies diferentes para o mesmo fragmento – que afectam a forma como migra. Consequentemente, as bandas observadas nem sempre representam os seus verdadeiros tamanhos e as imagens ficam desfocadas. Os géis de agarose nativos (onde as condições não perturbam as estruturas naturais dos analitos) tendem, portanto, a não ser utilizados para a análise de tamanhos de RNA, embora possam fornecer uma estimativa de quantidade e integridade. As alternativas incluem Northern blotting e eletroforese em gel de agarose desnaturante2 que utilizam condições capazes de romper estruturas secundárias.

Os géis de agarose também podem ser usados ​​para separar proteínas3 com base no seu tamanho e carga (ao contrário do DNA/RNA, as proteínas variam em carga de acordo com os aminoácidos incorporados). No entanto, devido ao grande tamanho dos poros nos géis de agarose, as proteínas são frequentemente separadas em géis de poliacrilamida que possuem poros menores, oferecendo maior resolução para pequenas moléculas de proteína.

Portanto, nos concentraremos na eletroforese em gel de DNA agarose no restante deste artigo.

Agarose é um componente do ágar. Ele forma uma matriz de gel 3D de moléculas helicoidais de agarose em feixes superenrolados mantidos por ligações de hidrogênio, com canais e poros através dos quais as moléculas são capazes de passar. Quando aquecidas, essas ligações de hidrogênio se quebram, transformando a agarose em líquido e permitindo que ela seja despejada em um molde antes de reiniciar (Figura 1).

A porcentagem de agarose incluída em um gel afeta o tamanho dos poros e, portanto, o tamanho das moléculas que podem passar e a velocidade com que o fazem. Quanto maior a porcentagem de agarose, menor o tamanho dos poros, portanto, menores serão as moléculas capazes de passar e mais lenta será a migração. No laboratório de biologia molecular, o gel de agarose 0,7-1% é normalmente usado para separações diárias de DNA, oferecendo uma diferenciação boa e clara de fragmentos na faixa de 0,2-10 kb. Fragmentos maiores podem ser resolvidos usando géis de menor porcentagem, mas eles se tornam muito frágeis e difíceis de manusear, enquanto géis de maior porcentagem proporcionam melhor resolução de fragmentos pequenos, mas são quebradiços e podem endurecer de forma irregular.

A eletroforese em gel é usada para separar misturas de biomacromoléculas, como DNA, RNA e proteínas. Esta técnica separa por tamanho molecular e/ou carga. Isto é conseguido atraindo moléculas através de um gel contendo minúsculos poros usando um campo elétrico.

Como o DNA não é visível a olho nu, um corante intercalante como o brometo de etídio (EtBr) é incorporado no gel durante a pega. Isso se liga ao DNA e fica fluorescente sob luz UV, permitindo que os fragmentos de DNA sejam visualizados. Quanto mais DNA estiver presente, mais brilhante será a banda.